细胞传代培养实验结果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十六细胞的传代培养1.实验目的掌握细胞的传代培养方法及操作过程。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

实验二十六细胞的传代培养

1.实验目的

掌握细胞的传代培养方法及操作过程。

2.实验原理

传代培养是维持组织细胞培养及常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行。

3.实验材料与试剂

培养的细胞，培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hanks液。

4.实验仪器与器材

CO₂培养箱，倒置显微镜，超净工作台，培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯。

5.实验步骤

（1）进入无菌室之前要用肥皂洗手，然后用75%酒精擦拭消毒双手。

（2）在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

（3）打开超净台的紫外灯照射台面30分钟左右，关闭超净台的紫外灯，打开风机清洁空气，除去臭氧。

（4）用75%酒精棉球清洁超净台台面，点燃酒精灯。(www.chuimin.cn)

（5）取出无菌试管和刻度吸管，安上橡皮头，经酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

（6）移去培养细胞的旧培养基，加入1~2mlHanks液或无血清培养基，轻摇培养瓶，将液体移出，以洗去残留的旧培养基。

（7）向培养瓶内加入1~2ml0.25%胰蛋白酶，盖好瓶盖，轻轻晃动培养瓶使消化液与细胞充分接触后平放培养瓶。然后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶移出。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

（8）加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO₂气体的进入，将培养瓶放回CO₂培养箱。

（9）对悬浮培养细胞，省去步骤（6）~（8）。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

6.注意事项

（1）传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰周围。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

（2）每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

（3）如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应丢弃污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基等。

7.思考题

（1）贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同？

（2）细胞培养成功的关键要素是什么？