细胞原代培养成功！生物技术制药实验指南

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十五细胞的原代培养1.实验目的掌握细胞原代培养的基本方法和操作过程以及无菌操作方法。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。一个鸡胚约100ml细胞悬液。

实验二十五细胞的原代培养

1.实验目的

（1）掌握细胞原代培养的基本方法和操作过程以及无菌操作方法。

（2）学会取材和细胞计数方法。

2.实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，为临床上的疾病治疗提供有效的实验依据。原代培养可分为消化法和组织块培养法，这里一并作介绍。

成纤维细胞结缔组织细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面。由于它为最易培养的细胞，呈典型的梭形，生长方式受到密度的限制，通常在培养中只有约50代的相对有限生命周期，对大多数细胞生物学研究来说，培养的细胞是相对未分化的细胞，是经蛋白酶消化破碎的整个组织或选择的组织得到细胞液中的存活细胞。

3.实验材料与试剂

9～10日龄鸡胚，培养基（RPMIl640或DMEM），小牛血清，0.125%胰蛋白酶，0.25%胰蛋白酶，Hanks液，75%酒精，双抗（青霉素和链霉素），0.5%水解乳蛋白或MEM培养液，7%NaHCO₃。

4.实验仪器与器材

CO₂培养箱，倒置显微镜，超净工作台，磁力搅拌器，离心机，培养瓶，青霉素瓶，小玻璃漏斗，三角烧瓶，灭菌培养皿，吸管，试管，移液管，无菌纱布，无菌眼科剪，废液缸，血球计数板，手术剪，镊子，大头针，离心管，75%酒精棉球，2%碘酒，水浴锅。

5.实验步骤

（1）配液：制备Hanks液中加青霉素使其含量分别为100μl/ml，100μg/ml，将胰蛋白酶调整pH7.6,置于37℃水浴锅预热备用。(www.chuimin.cn)

（2）取胚并剪碎：将消毒后的鸡蛋击碎壳后取出鸡胚置于灭菌培养皿中，去掉四肢及内脏，用Hanks液先洗去鸡胚体表血液，再移入灭菌三角杯中剪碎，加入5mlHanks液轻摇，静止1～2min使组织块下沉，吸上层悬液，用同法洗涤2次后，取出吹干。

（3）消化：从水浴锅内取出预热的胰酶，按组织量约3倍～5倍加入三角杯，1个鸡胚约5ml胰酶，三角杯加上塞，以免CO₂挥发及污染，37℃水浴20分钟，每5分钟摇一次，由于胰蛋白酶作用，使细胞与细胞间的氨基和羟基游离，待液体混而稍稠，此时再轻摇，见组织块在液体中不下降时，此时需要中止消化。（如果再继续消化下去，可破坏细胞膜，使细胞不易贴壁生长，如果消化不好，则细胞成团状，不易扩散。）

（4）洗涤：取出三角杯静止1分钟，待组织块下降后，吸去胰蛋白酶液，用10mlHanks液反复洗涤3次，以洗去胰酶，吸去上清，留组织块。

（5）吹打：加2ml含血清的5%水解乳蛋白营养液或MEM营养液，反复吸吹，使细胞分散，此时营养液浑浊为悬液。静止1分钟，加20ml营养液，此时细胞约为50～70个/ml，若大量细胞可继续加营养液吹打。一个鸡胚约100ml细胞悬液。

（6）细胞计数：取上述细胞悬液0.5ml加入1%结晶紫，柠檬酸2ml，置室温或37℃温箱中5～10分钟，充分混合用毛细吸管吸入血细胞计数板内，在显微镜下计数。

（7）计数后的细胞加入培养液，然后接种到培养瓶中，每瓶接种5ml，细胞密度为10⁵~10⁶个ml。

（8）接种细胞后的培养瓶水平放入37℃CO₂培养箱培养4小时后，细胞即可贴附于瓶壁，24～36小时生长成单层细胞。

6.注意事项

（1）要注意无菌操作，其要求应高于外科手术。

（2）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡酒精时间不能过长，以保证胚胎细胞活性。

（3）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1～10分钟，而是至少20分钟，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10分钟以上。如果胰酶作用过强，则这些细胞易被损伤而不易生存。

（4）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养基接触，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上而无法收集到。