动物细胞培养液配制实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十四动物细胞培养用液的配制1.实验目的熟练掌握培养基、Hanks、D-Hanks液等平衡盐溶液及消化液（胰酶液）的配制方法。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或者用来洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。

实验二十四动物细胞培养用液的配制

1.实验目的

熟练掌握培养基（RPMll640和DMEM）、Hanks、D-Hanks液等平衡盐溶液及消化液（胰酶液）的配制方法。

2.实验原理

细胞培养所用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基现已有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（10%～20%）。

Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或者用来洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。

胰蛋白酶（胰酶）溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶来消化贴壁细胞，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高（勿高于37℃）、作用时间长，对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH8.0、37℃时消化能力最强。溶液中的Ca²⁺、Mg²⁺和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca²⁺、Mg²⁺的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。

3.实验试剂

无离子水，小牛血清，合成培养基（RPMI l640或DMEM），青霉素，链霉素，NaHCO₃，NaCl，Na₂HPO₄，KH₂PO₄，KCl，酚红，NaHCO₃，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl₂，D-葡萄糖，MgCl₂·6H₂O，MgSO₄·7H₂O，酚红（2%）（配法：称酚红2g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO₃溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHCO₃溶液使最终体积为100ml。瓶装保存，备用）。

4.实验仪器与器材

滤泵（进口）1套，滤器（进口）1套，蒸馏器，高压灭菌锅，磁力搅拌器，锥形瓶，培液瓶，翻帽塞，饭盒，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。

5.实验步骤

（1）准备和安装过滤器

①清洗好过滤器，干燥，安装好一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，进行高压灭菌处理。

②在超净台内打开过滤器，架好，胶管一端接人滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管伸入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤。注意过滤后一定要检查滤膜是否完好无损，如发现滤膜有破损，需将液体再次除菌。

（2）合成培养基的配制

①去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏（去除无机和有机杂质），制三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理。

②待水温降至15℃～30℃，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间（2～4小时）使之充分溶解。

③配制RPMIl640培养基时应通人适量CO₂或加入6mol/L盐酸调pH至6.0左右，这样才能充分溶解。

④加入一定量NaHCO₃调节pH至7.0左右。

⑤加水至最终体积。

⑥在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250ml或500ml玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。

⑦瓶口封好，4℃冰箱贮存（RPMIl640培养基可以-20℃贮存）。

（3）生长培养基的配制

除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清（或胎牛血清）和抗生素。培养基分装成小瓶（100～200ml）以备使用，翻帽塞塞紧瓶口。按如下比例配制：基本培养基占80%～90%，小牛血清占10%～20%。按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/ml和100μg/ml。

（4）D-Hanks液的配制

①称取D-Hanks试剂。

表1-18　Hanks，D-Hanks液（g/L）的成分比较(www.chuimin.cn)