动物细胞培养器皿的清洗与灭菌实验结果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十三动物细胞培养器皿的清洗与灭菌1.实验目的学会细胞培养的各种器皿的清洗与消毒。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞培养的好坏直接与细胞培养器皿清洗的彻底与否有很大关系。③干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160℃，保温90～120分钟。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5～8小时。

实验二十三动物细胞培养器皿的清洗与灭菌

1.实验目的

（1）学会细胞培养的各种器皿的清洗与消毒。

（2）掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作。

2.实验原理

清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞培养的好坏直接与细胞培养器皿清洗的彻底与否有很大关系。清洗后的玻璃器皿，要求干净透明，无油迹，不能残留任何物质。如残留痕量的有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也会影响细胞生长。

灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不得当，即使达到了无菌效果但是却使被灭菌物品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值。因此，我们要选取既可达到灭菌效果又能保持灭菌物品有效成分是最终目的。下面在每种灭菌法中将分别介绍其适用范围。

3.实验试剂

70%或75%乙醇，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液（来苏儿水），0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸（工业），DEPC水〔体积分数0.1%的酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）〕。

4.实验仪器与器材

超净工作台，干燥箱，高压灭菌锅，过滤器，过滤泵，无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25mm，孔径0.22μm），微孔滤膜（直径90mm，孔径为0.22μm）。

5.实验步骤

清洗

（1）玻璃器皿的清洗

①新购置的玻璃器皿首次使用时要用自来水刷洗；使用过的玻璃器皿立即浸入清水，然后用洗涤剂清洗，自来水清洗数遍。

②玻璃器皿倒置自然干燥或放入烘箱中烘干。

③浸酸性洗液过夜（过酸）。

④从酸性洗液捞出后用自来水冲洗10～15次以去除残余酸液，再用蒸馏水涮洗3次，倒置烘干或放入烘箱中烘干。

⑤包装（牛皮纸）。

⑥高压（15磅20分钟）或干热（160℃2小时）灭菌。

⑦贮存备用。

（2）用于RNA提取的玻璃器皿的清洗

用于RNA操作的物品需经特殊处理以彻底去除RNA酶。

①洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍,倒置自然干燥或烘干。②浸酸性洗液过夜。

③从酸性洗液捞出后，自来水冲洗10～15次去除残余酸液。

④0.2mol/LNaOH浸泡半日。

⑤自来水清洗5～10次，蒸馏水涮洗3次，倒置晾干或烘干。勿使皮肤直接接触到被洗涤的物品（注意此步要求戴手套操作）。

⑥锡纸包装封口。

⑦干热灭菌180℃5～8小时或湿热灭菌15磅以上40分钟。注意：自第5步以后均应戴手套操作，勿用普通纸包装待灭菌物品，以免纸被烧焦。

（3）胶塞的清洗

①新胶塞应先用清水清洗之后，再用0.2%NaOH煮沸10～20分钟。

②自来水清洗10次。

③再用1%稀盐酸浸泡30分钟。

④自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌。

⑤旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水冲洗后，晾干，包装并高压灭菌后，以备使用。

（4）塑料制品的清洗

①用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍。

②次强酸洗液浸泡2～6小时。

③自来水冲洗10次以上，蒸馏水涮洗3次。

④浸泡在70%乙醇1小时以上，备用。

⑤临用前从70%乙醇中取出，在超净台内紫外线照射1小时左右方可使用。也可在洗净后不经70%浸泡，而用塑料袋包好，装箱后经60C_o照射灭菌。

（5）加样器头（Tip）和小离心管（EP管）的清洗

①新的国产Tip和EP管如用于非RNA提取时可用蒸馏水涮洗，晾干，高压灭菌后可以使用（方法同塑料制品）。

②当新的国产Tip和EP管用于RNA提取时，则用蒸馏水涮洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡过夜后晾干，高压灭菌后方可使用。(www.chuimin.cn)

③使用过的Tip和EP管用完后应浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/L盐酸溶液中。用清水洗过，再用较稀的洗涤剂液在超声波清洗仪中超声处理30分钟。自来水清洗5～6遍后，再用次强洗液浸泡2～24小时。自来水逐个充分冲洗并用蒸馏水涮洗，晾干，放入Tip架或饭盒内高压灭菌。

（6）洗液的配制

常用的洗液是硫酸—重铬酸钾溶液，配制方法：

①将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。

②将重铬酸钾液倒人酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分混合溶解。操作时务必注意安全，戴上防护眼镜和耐酸手套，穿上围裙，防止洗液溅到皮肤和衣物上。万一不慎溅到皮肤上应立即用大量清水冲洗。

洗液可根据需要配制成不同的强度。

表1-17　常用的洗液配方

消毒与灭菌

（1）物理消毒法

①射线消毒灭菌

主要采用60Co、X射线进行消毒灭菌，可用于牛血清和塑料制品的灭菌。

②紫外线消毒

用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常用的消毒方法之一。

a消毒方法现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与距离成反比，因此应根据消毒的目的适当设置消毒距离：进行空气消毒时灯管应距地面2.5m以内；台面的消毒应在80cm以内；培养器皿的消毒在30cm以内。

消毒的时间与效能存在一定关系，但不是绝对的：照射20分钟后，约有71%的细菌被消灭；40分钟后约有79%的细菌被消灭；60分钟后约有86%的细菌被消灭。紫外线照射时间再长也不是100%的灭菌，最多只能把90%的细菌消灭，过长的照射是没有意义的。故单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与其他消毒方法结合使用，如先用75%的酒精浸泡，再照紫外线消毒灭菌等。

b检查消毒灭菌效果照射后为检查超净台是否达到无菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90mm培养皿，20分钟后再转入37℃培养箱中培养72小时，观察细菌生长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符合无菌标准。

③干热灭菌

主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160℃，保温90～120分钟。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5～8小时。

④湿热灭菌

此方法也称为高压蒸汽灭菌，是目前使用的最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等）。

⑤滤过除菌

用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等，以0.22μm除菌为最佳，但对于较黏稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。

（2）化学消毒法

常用的消毒液有如下几种：

①70%（或75%）酒精：超净台里常备70%酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

②0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。

③来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷洒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。

④0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10分钟即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷洒和擦拭方式进行。

⑤乳酸蒸气：将乳酸放人坩埚内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1～3天。可将空气中漂浮的微生物杀死。

⑥37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸汽。1～3天后方可达到消毒空气的目的。

（3）煮沸消毒

急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15分钟后使用。

6.注意事项

（1）清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10～15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和EP管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净将会影响下一次使用的效果。

（2）干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。

（3）高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。

（4）牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等）。

（5）滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。

（6）使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸汽对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。

7.思考题

（1）哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。

（2）此外线消毒的适用范围和目的是什么？

动物细胞培养器皿的清洗与灭菌实验结果

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