免疫印迹杂交实验-生物技术制药实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十六Northern印迹杂交1.实验目的学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。Northern印迹基本原理与Southern印迹类似，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，否则将会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程，此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。Northern印迹上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。

实验十六Northern印迹杂交

1.实验目的

学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。

2.实验原理

Northern印迹杂交是在Southern印迹杂交的基础上发展而来的一种技术。其基本原理是：将RNA样品通过琼脂糖凝胶进行分离，再转移到固相支持载体上，用同位素或生物素标记的探针对固定于膜上的mRNA进行杂交，将具有阳性信号的位置与标准分子量分子进行比较，可知此mRNA的分子量大小，根据杂交信号的强弱进行比较，可知基因表达的丰度，因此这一技术广泛应用于基因的表达调控、结构和功能分析研究。

Northern印迹基本原理与Southern印迹类似，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，否则将会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程，此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。RNA膜转移完成后，杂交方法和一般核酸分子杂交类似。

3.实验材料与试剂

（1）待测细胞总RNA或mRNA。

（2）杂交探针同位素32P或生物素标记。

（3）5×甲醛凝胶缓冲液：

0.1mol/LMOPS（pH7.0）

40mmol/L乙酸钠

5mmol/LEDTA（pH8.0）制备方法：20.6gMOPS溶于800ml用DEPC处理过的50mmol/L乙酸钠溶液中，用2mol/LNaOH调节pH至7.0，然后加入10ml0.5mol/LEDTA，用DEPC预处理过的蒸馏水调节体积至1000ml，0.2μm微孔滤膜过滤，室温下避光保存。

（4）甲醛凝胶上样缓冲液：

1mmol/IEDTA（pH8.0）0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青

DEPC处理并高压灭菌，室温保存。

（5）100×Denhart's溶液，20×SSC，等预杂交、杂交所用试液与Southern印迹相同。

4.操作步骤

甲醛变性胶分离RNA样品：

（1）将适量琼脂糖加热溶于水，冷至60℃，加入5×甲醛胶电泳缓冲液和甲醛，使其终浓度分别为1×和2.2mol/L，在化学通风橱内灌制凝胶（电泳槽必须彻底冲洗干净）。

（2）取1个Eppendorf管，按以下体积配制样品：

4.5μ1RNA（总RNA30μg，mRNA0.3～3μg）

2.0μ15×电泳缓冲液

3.5μ1甲醛

10.0μ1甲酰胺：置65℃保温15分钟，迅速置冰浴中，稍稍离心。

（3）加入2μ1上样缓冲液。

（4）上样前凝胶预电泳5分钟，然后将RNA样品立即上样于加样孔中，另一加样孔加入标准分子量参照物（常用28SrRNA和18SrRNA）。

（5）在1×甲醛胶电泳缓冲液中电泳，恒压3～4V/cm，每1～2小时将阴、阳极电泳缓冲液混合一次。(www.chuimin.cn)

（6）电泳结束后，切下分子量标准参照物条带，溴化乙啶染色，紫外线下观察，照相。

Northern印迹

（1）上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。含有甲醛的凝胶可用DEPC预处理过的水漂洗以去除所含的甲醛。如果凝胶较浓（大于1%）、较厚（如大于0.5cm）或待测RNA片段较大（大于2.5kb），可预先将凝胶置0.05mol/LNaOH溶液中浸泡20分钟，然后用DEPC处理过的水漂洗，最后用20×SSC浸泡45分钟。

（2）切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切去，以便于定位。然后将凝胶置于一搪瓷盆中。

（3）在一塑料或玻璃平台上铺上一层Whatman 3MM滤纸，此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一盛有20×SSC的搪瓷盆中。滤纸的两端要完全浸泡在溶液中。将滤纸用上述溶液浸润，用一玻璃棒将滤纸推平，并排除滤纸与玻璃之间的气泡。

（4）裁剪下一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套，不可用手直接触摸滤膜，否则油腻的膜将不能被湿润，也不能结合RNA。

（5）将硝酸纤维素漂浮在去离子水中，使其从底部完全湿润。然后置于20×SSC中至少5分钟。

（6）将中和后的凝胶上下颠倒后，置于上述已铺上Whartman 3MM滤纸的平台中央。注意两者之间不能有气泡。

（7）在凝胶的四周用Parafilm膜封严，以防止在转移过程产生短路（转移液直接从容器中流向吸水纸），从而使转移效率降低。

（8）将湿润的硝酸纤维素膜小心覆盖在凝胶上，膜的一端与凝胶的加样孔对齐，排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触就不可再移动，因为从接触的一刻起，RNA已开始转移。

（9）将两张预先用2×SSC湿润过的与硝酸纤维素膜大小相同的Whatman 3MM滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排除气泡。

（10）裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸，厚5～8cm。将之置于Whatman3MM滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板，其上压一重量约500g的物体。转移液将在吸水纸的虹吸作用下从容器中转移到吸水纸中，从而带动RNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。

（11）静置6～18小时使其充分转移，其间换吸水纸1～2次。

（12）弃去吸水纸和滤纸，将凝胶和硝酸纤维素膜置于一干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。

（13）凝胶用溴化乙啶染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡6×SSC溶液中5min以去除琼脂糖碎块。