生物制药实验：Southern印迹杂交

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十五Southern印迹杂交1.实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。这种技术是由E．M．Southern在1975年首创，因此称Southern印迹杂交。放射自显影将Southern膜置于干净滤纸上，用含同位素的墨水在膜上作标记，以确定方位和检测放射自显影的效率。Southern印迹杂交技术在医学领域有哪些应用价值？Southern印迹杂交实验过程中应注意哪些问题？

实验十五Southern印迹杂交

1.实验目的

学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。

2.实验原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补配对原则形成双链，因此该杂交过程高度特异。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是将固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。这种技术是由E．M．Southern在1975年首创，因此称Southern印迹杂交。Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。这里主要介绍目前常用的电转法。电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。一般只需2～3小时，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极两种。

3.实验材料与试剂

印迹试剂

（1）待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。

（2）变性液1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH，高压灭菌。

（3）中和液1mol/LTris-HC1（pH8.0），1.5mol/LNaCl，高压灭菌。

（4）电泳液和转移液1×TBE或TAE。

（5）尼龙膜、铂金丝电极电转仪。

杂交试剂

（1）预杂交液5×Denhardt试液，50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.2%SDS，500μg/m1变性的鲑精DNA片段，50%甲酰胺（也可不用）。

（2）20×SSC，3mol/LNaCl0.3mol/L柠檬酸钠。

（3）2×SSC，0.1%SDS溶液。

（4）0.1×SSC，0.1%SDS溶液。

（5）0.1×SSC溶液。

（6）10mg/ml小牛胸腺DNA溶液（或鲑鱼精DNA溶液）。

（7）32P标记的DNA探针。

4.实验步骤

电转移

（1）取一定量的待测DNA样品，经适当限制性内切酶酶切后后，于琼脂糖凝胶电泳。

（2）电泳后的胶经溴化乙啶（EB）染色，在长波紫外线下观察电泳结果。

（3）切去无用的凝胶部分，将凝胶浸泡于适量变性液中，轻轻摇动1小时。对于较大的DNA片段（>15kb），可于变性前用0.2mol/LHCI预处理10分钟使脱嘌呤，再进行碱变性处理。

（4）将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量中和液30min，轻轻摇动，重复一次。将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。

（5）裁剪4张同凝胶大小相同或稍大的Whatman 3mm滤纸，浸泡于1×TBE或TAE中，取2张置于一海绵上。

（6）裁剪一张同凝胶大小相同的尼龙膜，置水中使其从底部向上浸润，然后置于1×TBE或TAE中浸泡。(www.chuimin.cn)

（7）将充分湿润的尼龙膜覆盖于凝胶上，一端与加样孔对齐，注意排除二者间的气泡。

（8）在尼龙膜上再覆盖两张润湿的Whatman3mm滤纸，然后盖上另一张海绵。

（9）海绵两侧夹上凝胶支持夹，置于电转仪中，注意尼龙膜一侧置于正极，凝胶一侧置于负极。

（10）300～600mA恒流电泳，4～8小时，循环水冷却。

（11）电转完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，干燥滤纸吸干。

DNA固定

尼龙膜可用短波紫外线照射几分钟，或者真空下80℃烘烤2小时，以使DNA固定于尼龙膜上。

放射性核素探针杂交

（1）将上述固定了DNA的尼龙膜浸泡于6×SSC溶液5分钟，充分湿润。

（2）尼龙膜置于一塑料袋中，加入适量预杂交液（0.2ml/cm²膜面积），尽量排除其中气泡，用塑料封口机将塑料袋口封牢。

（3）恒温水浴中保温2小时，当预杂交液加入了50%甲酰胺时，恒温42℃，不加甲酰胺时，恒温68℃。

（4）从水浴中取出塑料袋，去除部分预杂交液，加入单链DNA探针，排除气泡后，重新封好口。

（5）根据退火条件选择合适的温度保温。一般在45℃～68℃，视所用探针与待测核酸的同源性大小而定，保温16小时左右。

（6）杂交完毕，取出塑料袋，弃去所有的杂交液，取出滤膜，迅速浸泡于2×SSC和0.5%SDS溶液中，室温下不断振荡，10分钟，重复一次。

（7）将滤膜转至2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温下漂洗15分钟。

（8）滤膜转至0.1×SSC和0.1%SDS溶液中，65℃水浴振荡漂洗30分钟，直到用检测器检不出信号为止。

（9）室温下，0.1×SSC漂洗5分钟，滤膜晾干后放射自显影。

放射自显影

（1）将Southern膜置于干净滤纸上，用含同位素的墨水在膜上作标记，以确定方位和检测放射自显影的效率。

（2）用塑料薄膜把Southern膜包好，上压一张X线片，两边附增感屏，夹于暗盒中；-70℃曝光，24～48小时后洗片，本操作须在暗室中进行。

5.注意事项

（1）电转法不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物，因为硝酸纤维素膜结合DNA依赖于高浓度盐溶液，而高盐溶液导电性强，会产生强大电流使转移体系温度急剧升高，破坏缓冲体系，从而使DNA受到破坏。

（2）如果用寡核苷酸探针或同源性较低的探针，杂交温度可适当降低，届时洗膜温度也要视情况而定。

6.思考题

（1）Southern印迹杂交技术的基本原理是什么？

（2）Southern印迹杂交技术在医学领域有哪些应用价值？

（3）Southern印迹杂交实验过程中应注意哪些问题？

生物制药实验：Southern印迹杂交

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