哺乳动物细胞中外源基因的表达和检测

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十三外源基因在哺乳动物细胞内的表达及检测1.实验目的掌握真核细胞的培养方法、细胞转染以及Westernblot技术检测外源基因在哺乳动物细胞内的表达。哺乳动物基因转移载体通常都含有标记基因，以便于筛选出转染有外源基因的细胞。基因表达产物可采用免疫荧光抗体、免疫沉淀及免疫印迹等方法进行检测。哺乳动物细胞COS7。

实验十三外源基因在哺乳动物细胞内的表达及检测

1.实验目的

掌握真核细胞的培养方法、细胞转染以及Westernblot技术检测外源基因在哺乳动物细胞内的表达。

2.实验原理

哺乳动物细胞作为宿主表达系统具有许多优点：该体系能识别和除去外源基因中的内含子，最后可剪接加工为成熟的mRNA；同时该体系还能对蛋白质进行翻译后的加工修饰，从而使蛋白表达产物具有生物学活性；用作受体的哺乳动物细胞易被重组DNA转染，并且它还具有遗传稳定性和可重复性特点。

哺乳动物基因转移载体通常都含有标记基因，以便于筛选出转染有外源基因的细胞。外源DNA导入真核细胞的方法有许多种，常用的有磷酸钙转染法、电穿孔转染法、脂质体包裹转染法、显微注射及DEAE－葡聚糖转染技术。基因表达产物可采用免疫荧光抗体、免疫沉淀及免疫印迹等方法进行检测。

3.实验材料与试剂

（1）质粒：pNTE-EGFP（增强型带有绿色荧光蛋白标签的NTE全长表达载体）pEGFP-N3（Clontech）。

（2）哺乳动物细胞COS7。

（3）细胞培养试剂：DMEM（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）。

（4）抗生素：氨苄青霉素钠盐，硫酸链霉素（Sigma）；G418（Gibco）。

（5）细胞转染试剂：Lipofectamine 2000（Invitrogen）；Opti-MEMI培养基（Gibco）。

（6）DNA纯化试剂盒：Endofree Plasmid MaxiKit，Plasmid Midi Kit（Qiagen）。

（7）Western blot所用试剂：抗体：BD Living ColorsA.v.monoclonal antibody（JL-8）（BD Biosciences,Clontech）；Anti-mouseIgG（Fc specific）peroxidase conjugate，Monoclonal anti-HA clone HA-7（Sigma）；人杂交膜Hybond ECL（Amersham）；ECL底物：Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce）；X胶片（柯达公司）。

4.实验步骤

（1）细胞的培养

COS7细胞在含有10%胎牛血清的DMEM，5%CO₂，饱和湿度下培养。

（2）转染用DNA的纯化

按照Qiagen试剂盒说明书进行，测定DNA的浓度和纯度。

（3）细胞的转染

①转染前一天，将细胞接种至无任何抗生素的DMEM培养基的6孔细胞培养板中，使细胞密度保持在90%饱和度。

②将4μgDNA和10μl转染试剂Lipofectamine2000分别溶于250μl无抗生素和血清的opti-MEMI培养基中，轻轻混匀，室温放置5分钟。(www.chuimin.cn)

③将稀释的DNA和转染试剂温和混匀，室温孵育20分钟。

④将DNA和转染试剂的混合物加入到2ml无抗生素的DMEM培养基中，前后来回摇晃混匀后，37℃培养48小时，直接进行蛋白的表达检测。

（4）蛋白表达检测

检测方法一：显微观察

由于表达的蛋白质是与绿色荧光蛋白相偶联的，因此可以在转染48小时后直接在荧光显微镜下观察，如果细胞发出绿色荧光，说明外源基因在其内有表达。

检测方法二：Westernblot

①细胞蛋白的提取和定量

转染后的培养细胞在吸去培养液之后，用胰酶消化经离心收集细胞。用1×PBS漂洗2遍后，离心收集细胞，再加入一定量的细胞总蛋白裂解液（20mMMOPS，0.15MNaCl，1% NP-40，1%去氧胆酸钠，1mMEDTA，1%SDS）。最后加入裂解液和蛋白酶抑制剂（1mM PMSF、10μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin、2μg/ml Benzamodine）之后，充分悬浮细胞，冰上超声破碎细胞，12000g离心10分钟，取上清作为细胞蛋白提取物，用Lowry法测定蛋白浓度。

②蛋白质的SDS-PAGE

等量的蛋白（40μg）在加入上样缓冲液充分混匀后，沸水浴煮5分钟，瞬时离心后进行SDS-PAGE。

③蛋白印迹

将电泳后的蛋白胶在转移液（3.03gTris，14.4gGlycine，200mlMethanol/L）中浸泡至少20min；HybondECL膜在双蒸水中浸湿后，在转移液中平衡至少10分钟。半干转移法（BIO-RAD）转移3小时。

④封闭和杂交

将转移后的蛋白膜在封闭液（含5%脱脂奶粉和0.1%（V/V）Tween-20的PBS，pH7.5）中室温下封闭至少一小时。用洗涤液（含0.1%（V/V）Tween-20的PBS）稍稍洗两次后，再洗3次，每次10分钟。然后再加入适量稀释的一抗，在4℃孵育杂交过夜。杂交后按照上述洗涤步骤重复洗膜后，再加入按1∶1000稀释的二抗（偶联有辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体），在室温下孵育杂交至少1小时。按上述洗涤步骤继续洗膜。

⑤化学发光曝光和显影

按10cm²加1ml检测液计算，等比例混合ECL检测液A和B，滴加在膜的蛋白面上，室温放置5分钟后，吸掉过多的检测液，用保鲜膜包裹膜（注意要排除气泡），使蛋白面朝上，黑暗下进行X光片曝光，按显影—停影—定影步骤冲洗胶片。

附录

蛋白浓度测定（Lowry检测法）：

先配制溶液A（100ml含0.5gCuSO₄·5H₂O，1g柠檬酸）和溶液B（1L含20g碳酸钠，4g氢氧化钠）。用双蒸水稀释样品至0.5ml，然后加入2.5ml溶液C（1体积溶液A和50体积溶液B的混合物）混匀，在室温下放置5～10分钟。接着加入0.25ml溶液D（等体积的Folin-酚和双蒸水的混合物），混匀。最后室温放置20～30分钟后，在分光光度计上测A750值。

蛋白质浓度标准曲线的制作：以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，0、2.5、5、10、20、40、80μg/ml的浓度蛋白制作，每个浓度设定3个重复，取平均光吸收值作为纵轴，蛋白浓度为横轴，绘制标准曲线。

哺乳动物细胞中外源基因的表达和检测

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