RT-PCR方法成功扩增目的基因

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十一RT-PCR扩增目的基因1.实验目的掌握反转录PCR的原理及实验方法。反应过程先以单链RNA的基因组为模板，催化合成一条单链DNA，我们将其称为第一链DNA。RT-PCR可使RNA检测的灵敏度提高几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。PCR扩增目的基因①模板DNA：以上述反转录所得的cDNA为模板，进行3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的扩增。

实验十一RT-PCR扩增目的基因

1.实验目的

（1）掌握反转录PCR的原理及实验方法。

（2）掌握PCR技术原理和基本实验步骤。

2.实验原理

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR反应体系由模板DNA、引物、耐热性DNA聚合酶、底物（四种dNTP)、缓冲液和Mg²⁺等组成。其操作过程为变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是指加热条件下模板DNA双链间的解离，退火是指降低温度使模板DNA与高浓度引物间的互补结合，延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg²⁺等存在条件下扩增特定的DNA片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板，因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤，特定DNA片段的分子数目可增加一倍。引物设计是PCR技术的关键步骤，引物设计的特异性则直接影响扩增的效率及特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。

反转录（reverse transcription）也称为逆转录，是依赖RNA的DNA合成过程，它是以RNA为模板，在反转录酶作用下由dNTP聚合成DNA分子。反应过程先以单链RNA的基因组为模板，催化合成一条单链DNA，我们将其称为第一链DNA。第一链DNA与模板生成RNA:DNA杂化双链，杂化双链中的RNA在被RNA酶水解后，再以新合成的第一链DNA为模板，催化合成第二链DNA。催化此反应的酶称为逆转录酶，也称反转录酶。

反转录—聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是PCR技术的一种广泛应用形式，该反应的原理：首先提取组织或细胞当中的总RNA，再以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录生成cDNA第一链后，不需要再合成第二链，在特异引物的协助下，可从低丰度的mRNA反转录产物中扩增到近微克级的特异cDNA产物，用于重组、克隆。RT-PCR可使RNA检测的灵敏度提高几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要应用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针及构建RNA高效转录系统。

本实验通过提取培养细胞的总RNA，利用反转录酶进行反转录反应获得cDNA，作为PCR的模板扩增人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)基因（1008bp)，两个引物的5'末端分别引入EcoRI和BamHI两个酶切位点，为DNA重组实验做准备。