RNA琼脂糖凝胶检测：实验十成果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验十RNA的琼脂糖凝胶检测1.实验目的通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。采用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶，取抽提的细胞总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。

实验十RNA的琼脂糖凝胶检测

1.实验目的

通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度。

2.实验原理

分离出细胞的总RNA或部分RNA之后，根据它们在电场作用下迁移速率不同，可以通过电泳来分辨不同的RNA分子，这也是检测RNA分子是否降解的关键一步。电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。首先制备好“胶”，即一块包含电解质的多孔支持介质，然后将其置于静电场中，处于胶内的DNA/RNA分子在电场的作用下将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。当DNA/RNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。

依据制备凝胶所用的原材料不同，凝胶电泳又可分成两类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶可分离小片段DNA/RNA（5-500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，但其不足之处是制备和操作较为困难；而琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广泛。采用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶，取抽提的细胞总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。28S、18S、5.8S三条带完整清楚，无杂带无涂抹带且28S带的宽度及亮度约是18S的2倍则说明所提RNA完整无降解。

图1-9　细胞总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳所示条带

3.实验材料和试剂

（1）实验八中提取的RNA样品

（2）EDTA-Na₂·2H₂O（乙二胺四乙酸二钠盐）

（3）溴化乙啶（EB）

（4）琼脂糖

（5）Tris（三羟基氨基甲烷）

（6）冰醋酸

（7）溴酚蓝

（8）蔗糖或甘油

（9）二甲苯青FF

（10）加样缓冲液：（6×）Ⅲ型

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液，4℃保存。

（11）TAE，50×浓缩贮存液

Tris242g，冰醋酸57.1ml，100ml0.5mol/LEDTA,pH=8.0，加600ml水剧烈搅拌，定容至1000ml。

（12）0.5mol/LEDTA，pH=8.0

在800ml水中加入186.1gEDTA-Na₂·2H₂O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（EDTA-Na₂·2H₂O在溶液pH值接近8.0时，才能完全溶解），然后定容至1 L，分装后高压灭菌备用。）

（13）溴化乙啶贮存液（10mg/ml）

在100ml水中加入1g溴化乙啶，用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转移至棕色瓶中，4℃贮存。

4.实验仪器

电泳仪，电泳槽，天平，磁力搅拌器，pH计，微量移液器，紫外检测仪或紫外灯，各种玻璃器皿（各种规格烧杯、容量瓶及广口瓶），紫外防护镜。

5.实验步骤

（1）50×TAE的稀释：如制备50ml1×TAE，取1ml50×TAE加入49ml水定容至50ml。

（2）制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mlTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60℃，加入浓度为10mg/mL的EB2μl，使EB的终浓度为1μg/ml。

（3）用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3%的H₂O₂溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC水冲洗电泳槽，梳子同样处理。

（4）用胶带封住胶床，放好梳子。(www.chuimin.cn)

（5）将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3～5mm，凝固20～60分钟。

（6）在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子和胶带，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。

（7）向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。

（8）分别将RNA样品与加样缓冲液混合，（10μlRNA样品+2μl6×加样缓冲液），用微量移液器将12μl样品加入加样孔。

（9）正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。

（10）电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察，可以看到提取完整的RNA共有三条带，分别是5kb的28SrRNA,2kb18SrRNA及0.1～0.3kb的5.8SrRNA及tRNA，可以看到28S rRNA的含量约为18SrRNA含量的2倍，说明总RNA完整性良好，无降解。

6.注意事项

（1）影响泳动的四大因素：

①影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质：包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大，泳动速率愈快；颗粒物理形状愈大，与支持物的摩擦力越大，泳动速率越小。即泳动率与颗粒的分子大小、介质黏度成反比；与颗粒所带电荷成正比。

②支持物介质：DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片断。琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断；聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5～50bp）的核酸。

③电场强度：电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大，带电颗粒的泳动率愈快，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时，线性DNA分子的泳动率与电压成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。

④缓冲液离子强度：缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。Tris·Cl缓冲体系中，由于Cl^-的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常用TAE、TBE、TPE三种缓冲体系。缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度，缓冲液pH值与核酸样品的等电点相距越远，样品所携带电荷量越多，泳动速度越快。核酸电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件，使核酸分子带负电荷，向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度呈反比，电泳的最适离子强度一般在0.02～0.2。

（2）指示剂

电泳过程中，常使用一种由颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚兰——呈蓝紫色；二甲苯青——呈蓝色。溴酚兰的分子量为670Da，在不同浓度凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故普遍用作指示剂。二甲苯青的分子量为554.6Da，携带的电荷量比溴酚兰少，在凝胶中迁移率比溴酚兰慢，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，也有溴酚兰和二甲苯青混合应用。指示剂一般加在上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。

（3）染色剂

核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙啶染色法。溴化乙啶（EB)是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙啶，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常，在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。

由于EB见光易分解，故应存棕色瓶中于4℃条件下保存。单链DNA、RNA分子常存在自身配对的双链区，也可以嵌入EB分子，但嵌入量少，因而，荧光较低，其最低检测量为0.1μg。

（4）溴化乙啶是强诱变剂，有中度毒性，可致癌，使用这一染料时务必戴上手套。

7.思考题

（1）加样缓冲液的作用是什么？

（2）琼脂糖中加入EB的作用是什么？

附录

溴化乙啶溶液的净化处理：

（1）溴化乙啶浓溶液（浓度＞0.5mg/ml）的净化处理：

①加入足量的水使EB的浓度降低至0.5mg/ml以下。

②加入1倍体积的0.5mol/LKMnO₄，小心混匀后再加1倍体积的2.5mol/LHCL，小心混匀，于室温放置数小时。

③加入1倍体积的2.5mol/LNaOH，小心混匀后可丢弃该溶液。

（2）溴化乙啶稀溶液（如含0.5～1μg/ml溴化乙啶的电泳缓冲液）的净化处理：