RNA浓度、纯度测定及浓度调整实验-生物技术制药实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验九RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整1.实验目的掌握RNA浓度及纯度的测定方法，并能根据实验需要来调整其浓度。在一定范围内，DNA或RNA的光密度OD260与其含量成正比。对于RNA，根据其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。

实验九RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整

1.实验目的

掌握RNA浓度及纯度的测定方法，并能根据实验需要来调整其浓度。

2.实验原理

在分子生物学实验中，提取DNA或RNA后，往往需要测定其纯度和浓度，在纯度达到标准，浓度调整到所需浓度后，才能进行下一步实验。

在一些有条件的实验室里，常常利用DNA/RNA计算器，能够很方便、迅速地测定DNA/RNA浓度和纯度，但DNA/RNA计算器往往很昂贵。一般实验室常利用紫外分光光度计来测定DNA/RNA的浓度。

DNA链上碱基的嘌呤环和嘧啶环结构具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰在260nm处。单链核酸（RNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度较双链高。在一定范围内，DNA或RNA的光密度OD260与其含量成正比。

对于DNA，根据其在260、280、310nm下紫外吸收值A260、A280、A310，可确定其纯度和浓度。

对于dsDNA：1.0A260=50μg/ml

ssDNA：1.0A260=33μg/ml

纯DNA溶液的A260/280应为1.8±0.1，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则可能有蛋白质污染。

A310值是背景，若盐浓度较高，A310值也高。

对于RNA，根据其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。

1.0A260=40μg/ml单链RNA

纯品RNA的A260/A280比值应介于1.7～2.0，如果A260/280比值太低，说明可能RNA样品中污染了蛋白或苯酚；如果A260/280比值太高，则提示RNA有降解；A260/A230的比值应该大于2.0，否则就可能被异硫氰酸胍（TRizoL试剂成分）污染了。

3.实验材料和试剂

（1）实验八中最终提取的RNA样品

（2）浓盐酸

（3）甲醇

（4）乙酸钠(www.chuimin.cn)

（5）DEPC水

（6）3mol/L乙酸钠（pH5.2）

250ml溶液的配制：在200mlDEPC水中溶解102.025g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加入25μl原溶液DEPC，然后定容至250ml，放置过夜，高压灭菌15分钟。

4.器材及仪器

（1）离心机

（2）微量移液枪

（3）紫外分光光度计

5.实验步骤

（1）测定前，石英比色杯须用浓盐酸：甲醇=1∶1溶液浸泡1小时，随后用DEPC水彻底冲洗。

（2）以实验八中最终提取的RNA样品为例。原RNA样品中共有200μl水，向样品中加入2μl3mol/LpH=5.2的乙酸钠溶液，使其终浓度为0.03mol/L，充分混合进行沉淀，4℃12000g离心5分钟，去上清液，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，晾干，然后用DEPC水20μl溶解RNA。

（3）用DEPC水对待测样品做1∶1000倍数稀释（2μl样品加入1.998mlDEPC水）。

（4）分别测定样品的A260、A280及A230。

（5）分别计算样品A260/A280及A260/A230的比值。

6.注意事项

在实验过程中要严格控制RNA酶污染，保护RNA分子不被降解。

7.思考题

（1）怎样确定DNA或RNA溶液的浓度?

（2）根据你所测得的DNA或RNA的浓度，试计算如果把溶液浓度调节到0.1μg/μl应溶液中加入多少毫升的水?

RNA浓度、纯度测定及浓度调整实验-生物技术制药实验

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