提取真核细胞总RNA的生物技术制药实验成果

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验八真核细胞总RNA的提取1.实验目的掌握真核生物细胞基因组RNA制备及定量的基本方法。由于细胞内大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

实验八真核细胞总RNA的提取

1.实验目的

掌握真核生物细胞基因组RNA制备及定量的基本方法。

2.实验原理

获得高纯度和完整的RNA为许多分子生物学实验所必需，如Northern blot、cDNA合成及体外翻译等实验。由于细胞内大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在本次实验中我们所用的Trizol主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍为有效的RNA酶抑制剂，一方面它在裂解细胞的同时也使RNA酶失活，另一方面它可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来。苯酚可以促进RNA进入水相，氯仿则可以抽提苯酚。在使用Trizol、氯仿处理细胞，经离心后所得溶液可分为三层，分别是最上层的水相（含有RNA）、中间层的苯酚及最下层的黄色有机相（含有DNA及蛋白质）。

一个典型的哺乳动物细胞约含10～5μgRNA，其中约有80%～85%为rRNA，而mRNA仅占1%～5%。在基因表达过程中，mRNA作为蛋白质翻译的模板，编码细胞内所有的蛋白质，因此mRNA作为分子生物学的主要研究对象之一。mRNA分子种类繁多，分子大小不均一，但在多数真核细胞mRNA的3'末端都含有一段较长的多聚腺苷酸链（polyA）。因此，我们可以用寡聚(dT)亲和层析等方法从总RNA中分离出mRNA。

3.实验材料和试剂

（1）培养的293T细胞（或其他肿瘤细胞）

（2）DEPC水:100ml双蒸水中加入DEPC 0.1ml，充分振荡,37℃孵育过夜。高压灭菌，4℃保存备用。

（3）Trizol

（4）异丙醇

（5）氯仿

（6）70%乙醇（用DEPC水配制）

4.实验器材及仪器

（1）EP管

（2）微量移液器

（3）枪头

（4）冰盒

（5）低温离心机

（6）180℃烘箱

（7）高压灭菌锅

（8）一次性手套

（9）水浴

5.实验步骤

（1）培养细胞收集细胞1×10⁷～2×10⁷于1.5ml离心管中,加入Trizol 1ml，混匀，室温静置5分钟。

（2）加0.2ml氯仿,振荡15秒,静置2分钟。

（3）4℃离心，12000rpm，15分钟。(www.chuimin.cn)

（4）小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的1.5ml离心管中。注意要避免吸取两相之间的蛋白物质。

（5）加0.6ml的异丙醇,轻轻颠倒混匀，室温放置10分钟。

（6）4℃离心,12000rpm，10分钟。

（7）弃上清,加入70%乙醇1ml洗涤RNA沉淀。4℃离心,12000rpm，5分钟。

（8）弃上清，将沉淀晾干。

（9）加入适量DEPC水溶液溶解RNA（65℃促溶10～15分钟）。

（10）总RNA定量：RNA定量方法与DNA定量相似，RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。OD260值为1时约相当于40μg/ml单链RNA。

（11）结果分析：根据OD260可计算RNA样品浓度:RNA（mg/ml）=40×OD260×稀释倍数/1000。RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。

6.注意事项

（1）在实验过程中要严格控制内源和外源的RNA酶污染，保护RNA分子不被降解，因此整个提取过程要在无RNase的环境中进行。

（2）所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6小时以上。

（3）塑料器皿用0.1%DEPC水浸泡后高压灭菌后使用。

（4）配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12小时以上。然后高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

（5）操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

（6）设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

7.思考题

（1）RNA提取时需注意什么？

（2）TrizoL试剂在实验中的作用是什么？

（3）实验过程中，加入氯仿后，溶液共分为哪三相？

附录

常用的RNA酶抑制剂

（1）焦磷酸二乙酯（DEPC）是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

（2）异硫氰酸胍是Trizol中主要成分，为目前最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织细胞的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

（3）氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

（4）RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）从大鼠肝或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

（5）其他SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

提取真核细胞总RNA的生物技术制药实验成果

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