限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验七限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒1.实验目的了解酶切法鉴定重组质粒的原理。当EcoRI和ScalI同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。

实验七限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

1.实验目的

（1）了解酶切法鉴定重组质粒的原理。

（2）掌握单、双酶切的技术。

2.实验原理

当空质粒载体的多克隆位点插入外源DNA片段后，可以利用插入片段两端含有限制性内切酶位点，通过对重组质粒的酶切进行鉴定。如果使用单酶切，将会产生比空质粒大的片段，电泳结果表现为滞后片段；如果采用双酶切，将得到2条片段，其中一条与空质粒大小一致，另一条与插入DNA片段大小一致。

3.实验试剂

（1）10×酶切缓冲液

（2）EcoRⅠ酶；BamHI酶

（3）无菌水

（4）质粒pNTE-EGFP

（5）琼脂糖

（6）10mg/ml溴化乙啶溶液

（7）DNA分子量参照物（marker）

（8）50×TAE电泳缓冲液

（9）10×溴酚蓝上样缓冲液

4.实验器材

（1）恒温水浴

（2）电泳槽

（3）电泳仪

（4）电炉

（5）紫外线检测仪(www.chuimin.cn)

（6）微量移液器：10～100μl,0.5～10μl

5.实验步骤

（1）取2支微量离心管，按下表加入试剂，进行单酶切和双酶切反应。

表1-4　实验试剂表

（2）混匀，离心5秒。

（3）37℃，1小时。

（4）加入3μl10×溴酚蓝上样缓冲液，混匀后行1%的琼脂糖凝胶电泳，成像观察。

6.注意事项

（1）很多因素影响酶切反应，如质粒DNA不纯，样品中盐分过高以及痕量的酚等都会影响酶切反应。

（2）严格控制内切酶的用量占总反应体积的1/10。否则，甘油浓度过高会抑制酶活性。

（3）尽可能地降低反应总体积，增加酶与底物间的碰撞机会，进而增加反应速度。

7.思考题

DNA的酶切实验要注意哪些问题？

附录

各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，EcoRⅠ酶的识别顺序为：GAATTC；ScalI酶的识别顺序为：AGTACT，用EcoRI和ScalI同时酶切含有这两个酶切位点的环状双链DNA，就产生带有相应酶切位点的线性DNA分子。

当EcoRI和ScalI同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。不同酶切反应都需要Mg²⁺并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专用缓冲液。如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol/L时，EcoRI内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列（称该酶为EcoRI*）。绝大多数酶的反应温度是在37℃，酶切反应时间需30分钟、60分钟以至2小时以上。一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10小时，就可使大部分酶失活。EcoRI酶置65℃水浴中，保温10小时，丧失95%的酶活性。内切酶一般都保存在50%甘油的缓冲液中。当保存在10%甘油中时，酶活力丧失更快。少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol/L。EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就便于终止酶切反应。

酶切要完全，酶解的数量也要适当。设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50%。并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。

至于酶的用量，通常控制1U酶在15～20μl中酶解1μgDNA，但有时也要根据实际情况，对不同的DNA酶的用量有所不同，如EcoRI酶对4.3kb的pBR322有一个切点，而对14.5kb的pXZ6有两个切点，如果不考虑其他构型的影响，则每微克pBR322的酶用量与每微克pXZ6的用量之比应该为1.69∶1(酶单位)。

关于酶解的体积，一般酶切0.2～1.0μg的DNA时，控制反应体积为15～20μl。根据酶解DNA的数量，按比例适当放大体积。如果酶切反应总体积太大，将使DNA浓度与限制酶浓度稀释，分子之间难以接触，酶切效果就差，因而尽可能做到反应体积为最小。但是，酶切反应混合物中甘油的含量不能超过5%，否则将会抑制酶的活性(通常将酶量控制在反应总体积的1/10以下)。当使用的限制酶活性不高时，必须加大限制酶的用量。这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的10%，其酶切反应体积不可能保持到最小。另外，由于我们提取到的DNA，大多都是保存在TE缓冲液中。如果DNA浓度很稀，加入反应系统中的体积要增大，这时TE中的EDTA将会与酶的激活因子螯合，影响酶切效果。为此，也不得不放大反应体积或者将DNA重新浓缩。

双酶切时需要注意以下几点：（1）如果所用两种酶的反应条件完全相同（温度、盐离子浓度等）那么，可以将它们同时加到一个试管中进行酶切。（2）如果所用的两种酶对温度要求不同，那么要求低温的酶先酶切，要求高温度的酶后酶切，即在第一个反应结束后，再加入第二个酶，升高温度后继续进行酶切。（3）如果两种酶对盐离子浓度要求不同，则要求低盐的酶先消化，要求高盐的酶后消化，具体方法是：在低盐缓冲液中加入第一个酶，反应结束后，补加1/10体积的高盐缓冲液，加入第二个酶再消化，或第一个反应结束后抽提DNA，再用高盐缓冲液酶切。目前，各试剂商都提供了双酶切缓冲液或通用缓冲液，可以根据说明书进行操作。

限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

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