PCR产物的TA克隆在生物技术制药实验中的应用

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验六PCR产物的TA克隆1.实验目的掌握通过TA连接克隆PCR产物的原理和方法。因大部分耐热DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性，所以使用本品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。对克隆后的PCR产物用M13 Primers进行DNA测序。克隆时使用的InsertDNA片段尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

实验六PCR产物的TA克隆

1.实验目的

掌握通过TA连接克隆PCR产物的原理和方法。

2.实验原理

由于PCR的方法扩增所得目的基因并不清楚其DNA序列，因此，通常要通过TA克隆的方法，将扩增得到的目的基因重组到T-载体中，再通过测序获取DNA序列。在PCR过程中，根据所用DNA聚合酶不同，分为2种情况：①使用Taq酶，PCR扩增结束后，加上72℃10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3’末端加上A，因此PCR产物纯化后可以和T载体直接连接。②使用高保真DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3’末端加A，得到的DNA序列为钝端。因此，需要在回收纯化后进行加A过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP），72℃10分钟，然后将加A后的产物用于TA连接。

pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。它是由TaKaRa公司独自研发，从pUC18载体改建而成。在pUC18载体多克隆位点中的XbaI和SalI识别位点之间插入EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切后，再在两侧的3'端添加“T”而成。因大部分耐热DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性，所以使用本品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。本品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成，所以它具有与pUC18载体完全相同的功能。此外，本品中的高效连接液Ligation Solution I可以在极短的时间内（30分钟至1小时）完成连接反应，大大地方便了实验操作。另外，本制品中还含有ControlInsert(500bp)，可用作对照。

用途：克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物用M13 Primers进行DNA测序。α互补和蓝白筛选原理：许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片段基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶特点，此现象称为α互补。由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶，可用X-gal显色测定，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，从而导致不能形成有活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的，而没有插入外源片段的则是蓝色的。

3.实验试剂

（1）pMD18-TVector试剂盒，或自己PCR扩增回收纯化的片段。

（2）T4DNA连接酶

（3）IPTG，200mg/ml,过滤除菌。

（4）X-gal，20mg/ml的X-gal溶于二甲基甲酰胺，避光保存。

（5）LB培养基等.

4.实验步骤

（1）在微型离心管中加入下面成分，总体积10μl。

表1-3　实验成分表