DNA回收和纯化的生物技术实验

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验四DNA的回收及纯化1.实验目的了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法，掌握应用试剂盒回收DNA的技术方法。其回收率分别为85%和70%左右。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温，洗脱吸附于玻璃粉上DNA，再次离心收集含DNA的上清液即可。

实验四DNA的回收及纯化

1.实验目的

了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法，掌握应用试剂盒回收DNA的技术方法。

2.实验原理

DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术。产物纯度与回收率是该实验中两个重要的技术指标：纯度不纯将严重影响后面的酶切、连接、标记等反应；回收率低将会大大增加前期工作量。

PCR产物回收试剂盒的基本原理是，在高盐状态下，纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在几分钟内从PCR反应液，或十几分钟内从普通琼脂糖凝胶中回收高纯度的PCR产物，用于DNA测序及其他酶促反应。其回收率分别为85%和70%左右。该系统不仅用于纯化PCR产物，还可以从反应液或普通琼脂糖凝胶中回收各种类型的DNA片段，适用范围从150bp到十几kb。

3.实验试剂

（1）PCR产物

（2）TAE电泳缓冲液

（3）10×DNA电泳样品缓冲液

（4）琼脂糖

（5）无菌水

（6）溴化乙啶（EB）

（7）PCR产物回收试剂盒（纯化树脂，离心纯化柱）

（8）80%异丙醇或80%乙醇

（9）超纯水或TE缓冲液

4.实验仪器

（1）台式高速离心机

（2）水浴锅

（3）电泳仪、电泳槽(www.chuimin.cn)

5.实验步骤

（1）将50～100μlPCR反应液（或酶切反应液）在1%的琼脂糖凝胶上电泳后，切下所需的DNA条带，装入2ml离心管中，尽量切掉多余的琼脂糖凝胶。

（2）200～400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），70℃保温5～10分钟，每两分钟颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。对于高浓度的琼脂糖凝胶（>2%），每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂，加热融胶的时间延长到15分钟。

（3）将混合液移入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，弃去收集管中的废液。

（4）加入500μl80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，弃去收集管中的废液。

（5）13,000rpm离心2分钟，如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟,务必将异丙醇（或乙醇）除尽。

（6）将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放置2～3分钟，务必使乙醇充分挥发，加入40μlTE缓冲液（若用于测序，则加40μl纯水）于纯化树脂上，注意不能粘在管壁上。放置2分钟充分反应后，13,000rpm离心30秒。

（7）离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃保存备用。

图1-6　实验示意图

6.注意事项

（1）纯化树脂（于GS结合液中）为灰褐色粉状物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。

（2）室温低于25℃时，纯化树脂（于GS结合液中）可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。

（3）TE缓冲液或超纯水的用量视对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。

附录——常用的DNA回收方法

1.低熔点胶法低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的，这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化，这一温度尚不足以使DNA分子变性。操作时可先灌一块普通的胶，然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化，再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应，因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质，并且收集的胶条能在酶反应的合适温度（37℃）始终保持液体状态。

2.玻璃粉（乳）法将胶条割下加入NaI溶液浸泡，剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉（乳），室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温，洗脱吸附于玻璃粉上DNA，再次离心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4～1kb的小分子片段，均有80%的回收率。

3.QIAgen胶回收试剂盒由于凝胶溶于含NaI的溶胶液，DNA能专一地与离心柱中纤维素结合。结合后的DNA经洗涤除去杂质，最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。

DNA回收和纯化的生物技术实验

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