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质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验教程

2023-12-07 百科知识版权反馈

【摘要】：实验三质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测1.实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。溴化乙啶染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙啶分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。质粒在正常情况下以cccDNA构型存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。

实验三质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

1.实验目的

了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。

2.实验原理

带电物质在电场中的定向运动称为电泳。核酸分子是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA电泳速率与电荷效应无关，这是由于随着碱基数的增加，DNA分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常数。当不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。通常DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。值得注意的是，等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。

溴化乙啶染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙啶分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。

图1-3　溴化乙啶染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用

图1-4　琼脂糖凝胶电泳分离大小不等的DNA片段示意图

3.实验材料与试剂

（1）质粒pUC118

（2）琼脂糖

（3）10mg/ml溴化乙啶（EB)溶液小心称取1g溴化乙啶，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。用铝箔包裹装液管，4℃贮存。

（4）DNA分子量标准（Marker)

（5）50×TAE电泳缓冲液

Tris碱242g，57.1ml的冰乙酸（17.4mol/L），200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0)，用水定容至1000ml。

（6）6×溴酚蓝上样缓冲液（100ml)溴酚蓝0.25g，蔗糖40g，10mM EDTA（pH8.0）0.2ml,4℃保存。

4.实验器材

（1）恒温水浴

（2）电泳槽

（3）电泳仪

（4）微波炉

（5）微量移液器:100～1000μl，10～100μl,0.5～10μl(www.chuimin.cn)

（6）透射紫外观察仪

5.实验步骤

（1）称取1.0g琼脂糖，加入100ml1×TAE电泳缓冲液中,加热使琼脂糖溶解。

（2）凝胶冷却至60℃左右，加入溴化乙啶至终浓度为0.5μg/m1。

（3）选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部距离电泳胶模底部1.0mm。

（4）将琼脂糖溶液倒人模具，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，注意避免产生气泡。室温下15～30分钟后，琼脂糖溶液完全凝固。

（5）小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，将电泳胶模放入电泳槽，加样孔在负极端。

（6）加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，液面高于胶面1～2mm，如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。

（7）取15μl DNA样品，加入1/10体积的上样缓冲液并混匀。（注：注意点样品要放阴极端！每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染；注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。）

（8）用微量移液器将DNA样品加入梳孔中，记录样品点样顺序。

（9）接通电源，电压选择为3～5V/cm，使DNA样品向正极移动。注意：长度以两个电极之间的距离计算。

（10）当指示剂迁移距离超过凝胶长度的2/3时，即可终止电泳；切断电源后，凝胶可以直接在紫外线灯下观察或拍照。注意要在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜（全班共用一张保鲜膜），赶去气泡，然后将胶槽内的胶块小心滑出至样品台上面。

6.注意事项

（1）加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。

（2）EB有潜在的致癌危险，操作时必须戴乳胶手套或一次性手套。

（3）紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。

（4）相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。质粒在正常情况下以cccDNA构型存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA)；开环DNA（ocDNA）；线形DNA（LDNA)

图1-5　三种构型的质粒的电泳模式图谱

7.思考题

哪些因素影响带电粒子在电场中泳动？

附录

表1-1　琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最适分辨范围