实验三质粒的大规模制备1.实验目的掌握质粒大规模制备的原理及基本流程。大肠杆菌重组质粒的提取纯化工艺主要建立在常规碱法制备和柱层析分离纯化的基础上。经过上述碱裂解法制备的质粒DNA，还含有大量杂蛋白、内毒素及部分基因组DNA、RNA，因此在大规模制备时，一般采用柱层析方法进行分离纯化。同时也应防止DNase引起DNA的降解。......
2023-12-07
大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化实验
【摘要】：实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化1.实验目的掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒的化学转化法。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng质粒pUC118DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
1.实验目的
掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒的化学转化法。
2.实验原理
感受态是细菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用冰冷的CaCl2溶液处理大肠杆菌，使细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，细胞膜的结构被改变，细菌处于短暂的“感受态”。此时，这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106～2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒黏附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。质粒DNA的转化是重组DNA技术中重要的一环。
3.实验材料与试剂
（1）菌株DH5α等
（2）质粒pUC118（ampicillin，AmpR）
（3）100mmol/LCaCl2
称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07MPa高压灭菌30分钟，4℃保存。
（4）氨苄西林（100mg/ml）
用无菌水配制并过滤（0.22μm）除菌，滤液于-20℃冰箱中保存。
（5）LB培养基
细菌培养用胰蛋白胨10g
细菌培养用酵母提取物5g
NaCl5g
加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5MNaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000ml。高压15lbf/in2（1.034×105Pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄西林（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。
（6）LB平板LB培养液中加入1.5%琼脂粉，高压灭菌，稍冷却后铺平板。
（7）含抗生素LB平板配方同上，高压灭菌后，待含有琼脂的培养基冷却至65℃左右，加入氨苄西林，使之成为终浓度为50～100μg/ml培养液，倒入培养皿，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存。
（8）培养皿及1.5ml离心管等。
（9）恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）
（10）42℃恒温水浴(www.chuimin.cn)
（11）玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）
4.实验步骤
（1）将冷冻保存的DH5α菌种接种在LB平板上，37℃培养过夜（约16小时）。
（2）从LB平板上挑取DH5α单个菌落接种在5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。
（3）次日取0.5～1.0ml上述菌液，接种于50ml新鲜LB培养液中，37℃振荡培养（2~3小时）,待OD600=0.4-0.5，立即置冰浴10～15分钟。
（4）将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。
（5）将沉淀的菌体悬浮于20m10.1mol/L冷CaCl2内，冰浴中放置30分钟，4℃3000r/min离心10分钟,弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。
（6）沉淀的菌体再悬浮于2m10.1mol/L冷CaCl2溶液（操作要轻）,并置于冰浴中（感受态细菌可以在12.5%的无菌甘油-70℃保存）。
（7）取大肠杆菌DH-5α新鲜感受态细胞100μl于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng质粒pUC118DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。
（8）42℃热激活90秒后，立即放入冰浴,放置2～5分钟。
（9）加入LB液体培养基900μl，37℃剧烈振摇培养60分钟（转速不低于225rpm）。
（10）取100μl转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100μg/ml的LB固体平板上，37℃倒置培养16～24小时。
（11）观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。
5.注意事项
（1）制备感受态细胞的全部操作均须在冰浴低温条件下进行，同时注意无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。
（2）42℃热激活时间长短很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热激活过程中离心管不要摇动。
（3）菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
（4）实验用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等，应彻底洗净并进行高压消毒，表面去污剂及其他化学试剂的污染往往大幅度地降低转化率。
6.思考题
影响CaCl2法转化率的因素有哪些？
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